不同復溫方法對液氮保存人同種瓣活性影響的實驗研究

目的：尋找一種能最大程度保持液氮貯存人同種主動脈瓣活性的復溫方法。自增壓液氮罐
方法：同種主動脈瓣(n=36)隨機分為6組，Ⅰ組為新鮮同種主動脈瓣，Ⅱ～Ⅵ組經液氮保存3月后，分別采用①42℃水浴復溫(Ⅱ組)，②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)，③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)，④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)。將同種主動脈瓣復溫至4℃，對所有同種主動脈瓣進行臺盼藍染色活細胞計數、24小時葡萄糖代謝率測定，氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入、瓣膜組織培養。
結果：上述指標Ⅰ組顯著優于其余各組(P＜0.05)，Ⅳ組優于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養Ⅰ組細胞生長優于其余各組，且早于各組3～4天。
結論：不同復溫方法對同種主動脈瓣活性影響不同，以4℃/min勻速復溫法對同種主動脈瓣活性影響最輕。

關鍵詞：同種 主動脈瓣 活性

　　我們通過本研究觀察不同復溫方法對同種瓣活性的影響，旨在尋找一種能較好保持同種瓣活性的復溫方法，為臨床合理應用同種瓣提供依據，現報道如下。

材料與方法
　　1.取材分組　于1995年10月～1996年5月選擇46例健康成人腦死亡者，于死亡30分鐘內，在無菌條件下取出心臟，隨機抽取36例(年齡20歲～32歲，平均26歲)分為6組(n=36)。4℃生理鹽水
沖洗、修剪，保留主動脈瓣，插入銅-康銅熱電偶測量電極，將同種瓣置入含萬古霉素(50mg/L)、二性霉素(25mg/L)的RPMI1640液，經4℃過渡2小時后移入液氮氣相中放置2小時，然后置入液氮中，保存3月后取出，分別以①42℃水浴復溫(Ⅱ組)；②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)；③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)；④(10.0±2.0)/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)的速率將同種瓣復溫至4℃，新鮮未冷凍同種瓣對照(Ⅰ組)。
　　2.溫度測量控制裝置與方法　根據升降式降溫儀原理，自制復溫裝置，如圖1所示。

圖1　升降式溫度測量控制裝置
1　液氮容器　2　銅-康銅熱電偶
3　同種瓣保存袋　4　液氮　5　旋轉升降器　6　冰瓶
7　植物油　8　標準探極　9　冰水　10　數字式萬用電表

　　3.測量探極置于同種瓣葉內，標準探極插入冰水瓶，測量兩探極之間電勢差，依公式與攝氏溫度換算。根據復溫速度要求，將含有同種瓣材料的托盤，通過細繩由旋轉升降器牽引上升，利用萬用電表顯示電勢差，控制升降速率。換算公式：U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3，其中U為電勢差值(單位：mV)，t為攝氏溫度值(單位：℃)。
　　4.實驗方法　①臺盼藍染色法：0.25%胰酶消化剪碎的主動脈瓣葉，270目纖維濾膜過濾，濾液1200轉/分離心15分鐘，棄上清液，按1∶1將5%臺盼藍加入細胞懸液，光學顯微鏡計數。②葡萄糖代謝率測定：每10mg瓣膜組織中加入RPMI1640液1ml，在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小時后用自動生化分析儀作葡萄糖定量測定。代謝率［mmol/(mg．24h)］其中RPMI1640液原液同條件下葡萄糖定量為11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入量：瓣葉組織在孵育中加入3H-TdR 2μci，24小時后取出瓣葉，經漂洗后加入2mol/L NaOH，加熱將其溶解，加入閃爍液10ml，用自動液閃計數儀計數(CPM)。3H-TdR參入量［CMP/(mg．24h)］=，其中RPMI1640原液本底為27CPM。④組織培養：以組織塊貼壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培養液培養，每周換液2次，每次半量，待組織塊周邊有細胞長出后，拍照。
　　5.統計學方法　臺盼藍染色活細胞百分率行組間χ2檢驗，葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示，行組間t檢驗，P＜0.05差異有顯著意義。

結　果
　　臺盼藍拒染細胞百分率、葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量結果見表1。表1顯示：Ⅱ～Ⅵ組活細胞百分率(主要為內皮細胞)顯著低于Ⅰ組(P＜0.05)；而Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)；Ⅰ組葡萄糖代謝率、3H-TdR參入量顯著高于其它各組(P＜0.05)，Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養Ⅰ組細胞生長優于其余各組，且早3～4天。Ⅱ～Ⅵ組培養，Ⅳ組細胞生長優于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組。

討　論
　　同種瓣形態結構的完整決定著其耐久性。瓣膜冷凍保存不同于單細胞，由于細胞成分多樣，細胞間質存在，在復溫過程中，使熱量交換不均勻，外周組織內冰晶融化可從內部吸收熱量，使內部組織再結晶加重，可造成細胞嚴重的機械性損傷。另外，低溫蛋白質的變性，脂質的丟失，細胞膜通透性的改變以及細胞膜上小孔的形成，使水分子易通過細胞膜，引起細胞內水負荷加重，超過一定時間或程度時，細胞便會破裂。本研究結果發現，不同復溫速率對液氮保存的同種瓣均有損害。臨床上常用的42℃水浴復溫法，其復溫速率不均勻，細胞損害重，活性低，可能與細胞再結晶重，高水負荷狀態持續時間長有關。30℃/min和10℃/min復溫，溫差大，細胞內再結晶重。1℃/min復溫，雖然再結晶輕，但細胞內高水負荷持續時間長，細胞損害亦重。4℃/min復溫方法較好地保持了細胞活性，可能與熱交換時間充裕，再結晶輕，細胞內高水負荷狀態未超臨界值有關。自增壓液氮罐